Immunofissazione

Una tecnica efficacemente impiegata per l’identificazione di  singole proteine nei liquidi biologici e per  la classificazione di Componenti Monoclonali nel plasma e nelle urine.

L’immunofissazione è basata su di un principio piuttosto semplice. Si tratta della fissazione in situ, mediante antisiero monospecifico, di una singola proteina contenuta nel tracciato elettroforetico.Dopo elettroforesi è possibile precipitare una singola individualità proteica mediante completa immersione della membrana in antisiero diluito; la reazione con il rispettivo antigene darà luogo alla formazione di uno stabile immunoprecipitato.

La membrana, successivamente lavata in soluzione salina per rimuovere le proteine non precipitate, viene trattata con opportuna soluzione cromogena al fine di evidenziare, mediante colorazione diretta, l’immunocomplesso fissato nelle maglie della membrana stessa (metodo secondo Aguzzi e Rezzani). La concentrazione della Componente Monoclonale, nel campione, deve soddisfare le condizioni di equilibrio necessarie per la formazione di uno stabile immunocomplesso dopo il trattamento con l’antisiero.

Introduzione

Il procedimento qui descritto è senza dubbio quello più  consono alle esigenze interpretative: si tratta della immunofissazione (IFE) che consiste nel precipitare, immediatamente dopo la separazione elettroforetica, una singola proteina per mezzo dell’antisiero monospecifico corrispondente.

Le altre proteine, non fissate, vengono rimosse con lavaggi ed è pertanto possibile la comparazione diretta con il tracciato in esame.

L’immunofissazione è una metodica prevalentemente usata per identificare le componenti monoclonali (CM) presenti in un tracciato elettroforetico.

Queste devono essere quantificate in  precedenza densitometricamente in quanto il siero deve essere diluito sino a portare la concentrazione della CM nell’ambito dei 50/200 mg%. questo è infatti l’ambito di concentrazione consigliabile per ottenere una buona immunofissazione.

Il riconoscimento della monoclonalità di una immunoglobulina elettroforeticamente omogenea si basa sulla dimostrazione che questa monta lo stesso tipo di catene leggere e pesanti. Pertanto l’identificazione della maggior parte delle CM è ottenibile con l’impiego dei cinque antisieri anti IgG, IgA, IgM, Kappa e Lambda. La metodica proposta da PhoreGel consente, grazie all’impiego di antisieri monospecifici prediluiti, di eseguire il contatto tra antigene ed anticorpo immergendo il supporto elettroforetico direttamente nell’antisiero garantendone in completo contatto ed evitando di ricorrere a scomode incubazioni in camera umida.

Consigli pratici: Il campione da utilizzare può essere siero o urina (specie per la ricerca della proteina di Bence Jones): nel caso in cui si utilizzi siero, si dovrà avere l’accortezza di prediluirlo con soluzione fisiologica, sino a portare la concentrazione della presunta C.M. entro il range di 50-200 mg%.

La tecnica consente l’esecuzione in parallelo di quattro campioni utilizzando sei strisce di acetato di cellulosa.

La prima striscia, su cui dovranno essere  depositati i campioni interi, non dovrà essere sottoposta al trattamento con antisieri e soluzione ipertonica, ma direttamente colorata e decolorata dopo la migrazione fornirà i tracciati di repere.

Le strisce, su cui andranno depositati i campioni prediluiti, dovranno essere contrassegnate ed immerse, al termine della migrazione, rispettivamente nelle apposite vaschette precedentemente preparate con gli antisieri anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-K ed anti- l.

Dopo circa 15′ di completa immersione sotto leggera agitazione periodica, gli antisieri contenuti nelle vaschette andranno recuperati, riversati nei rispettivi flaconi, e conservati (a4/8°C); senza spostare le strisce, si potrà a questo punto versare in ogni vaschetta un adeguato quantitativo di soluzione ipertonica, (circa 40ml), eseguire due lavaggi di circa 10-15′ sotto agitazione,  sostituendo ogni volta la soluzione; colorare, decolorare ed esaminare preferibilmente con l’ausilio di un transilluminatore.

MATERIALI E STRUMENTI

1)-Camera umida per elettroforesi 
2x M010C2 o 1x M010C4   o in alternativa     sistema semiautomatico/automatico

2)-Applicatore semimicro per 4 campioni . M010D4

3)-Alimentatore per elettroforesi 
MSTC30

4) Transilluminatore a luce opaca (optional)

REAGENTI,  PREPARAZIONE

1)-Tampone LTC25 (Conc.4x) 
Portare al volume di 1000ml           con  H2O deionizzata

2)-Acetato secco AM0100
Idratare in tampone per 10′ 

3)-Colorante Nero D’Amido o Blu Coomassie cod. LC0N02 o LC0B02 
Pronti all’uso

4)-Soluzione decolorante LD0002
Conc 20x

5)-Kit Immunofissazione WFIX25
contenuto: 5 Antisieri Prediluiti (anti IGA – anti IGG – anti IGM – antiK – anti Lambda); 5 vaschette di reazione e rispettive etichette. 
Trasferire l’intero contenuto (circa 20 ml)  di ogni flacone di antisiero prediluito  nella rispettiva vaschetta di reazione.

6)-Reagenti ausiliari: soluzione di lavaggio  (sol. fisiologica) 

Fasi di lavoro

Semimicro

Campione con componente monoclonale in zona Beta2, di tipo
IGA Lambda: la concentrazione della C.M. è di circa 500 mg/dl.

Campione con componente monoclonale in zona Gamma, di tipo
IGG Lambda: la concentrazione della C.M. è di circa 1000 mg/dl.

Campione con componente monoclonale in zona Gamma2, di tipo
IGG Lambda: la concentrazione della C.M. è di circa 1000 mg/dl.

Campione con componente monoclonale in zona Gamma, di tipo
IGG Lambda: la concentrazione della C.M. è di circa 800 mg/dl.

Campione con componente monoclonale in zona Gamma3, di tipo  IGG Lambda.

La concentrazione della C.M. è di circa 1500 mg/dl.
Sono presenti catene leggere libere di tipo Lambda nelle urine (proteina di B.J.).

Campione con componente monoclonale in zona Gamma3, di tipo
IGG Lambda: la concentrazione della C.M. è di oltre 2000 mg/dl.

Campione con componente monoclonale in zona Gamma2, di tipo  IGG Lambda:

la concentrazione della C.M. è di circa 1000 mg/dl.

Campione con componente monoclonale in zona Gamma, di tipo
IGM Kappa: la concentrazione della C.M. è di oltre 1000 mg/dl.

Possibili Problematiche:

Campione con componente monoclonale in zona Gamma, di tipo
IGM Kappa: la concentrazione della C.M. è di circa 1500 mg/dl.
In questo caso è presente un precipitato in corrispondenza di tutti gli antisieri: non si tratta di una reazione immunochimica, ma di crioglobuline, rimaste sul punto del deposito. La reazione è avvenuta solo in corrispondenza degli antisieri anti-M e anti-K come si evidenzia dalla maggiore intensità di colorazione.

Campione di urina con presenza di catene leggere libere di tipo Lambda (proteina di Bence Jones).

Campione con apparente  componente monoclonale in zona Beta, risultata essere invece espressione di un’eterozigosi della transferrina (è stato necessario usare anche l’antisiero anti-tf)